石蜡包埋组织miRNA提取试剂盒

产品货号：

WH0127

中文名称：

石蜡包埋组织miRNA提取试剂盒

英文名称：

FFPE miRNA Extraction Kit

产品规格：

50次

发货周期：

1～3天

产品价格：

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本试剂盒提供独特的裂解和孵育条件，可以逆转福尔马林对RNA造成的交联。在二甲苯脱蜡后，利用特别研制的裂解缓冲液处理，可有效地将RNA从组织切片中释放出来，并用DNase I消化，避免了基因组DNA污染。经硅基质膜纯化后可获得＞18nt的RNA，产物可直接用于RT-PCR、RT-qPCR、Northern Blot Analysis、MicroArray Analysis等下游实验。

试剂盒特点：

针对性强：专为提取FFPE中的miRNA设计，试剂盒组分进行特别优化；
纯度高：柱法纯化，产物无gDNA和盐离子污染；
简单快速：2h内即可获得高质量的miRNA。

提取流程图：
石蜡包埋组织miRNA提取试剂盒提取流程图

实验实例：

选取大鼠肝石蜡切片，每片厚度约10μm。提取该切片的miRNA，再依次进行反转录(货号：WH0131)和荧光定量PCR(货号：WH0132)，检测目的miRNA。
A：提取两张切片样本，并检测miR-16的表达量。每张切片设立2个重复。扩增曲线显示本试剂盒能够高效稳定的提取石蜡切片样本中的miRNA。
B：本试剂盒与国外知名公司A和B的同类试剂盒提取组织切片的miRNA，每个试剂盒提取两张切片，所有切片均来自同一组织样本。提取之后进行反转录并检测miR-194的表达量。图中实验结果显示，本试剂盒提取得率略高于同类竞品试剂盒。

试剂盒组成：

组分	规格
裂解液RF	12mL
缓冲液RB	2×12mL
漂洗液RW	12mL
Proteinase K	500μL
RNase-Free ddH2O（瓶装)	15mL
RNase-Free吸附柱CR3（含2mL收集管)	50套
DNase I	1500U
缓冲液RDD	4mL
RNase-Free ddH2O（管装)	1mL
RNase-Free离心管（1.5mL)	50个

储存条件：15～25℃，DNase I，缓冲液RDD和RNase-Free ddH2O（管装）置于2～8℃保存

自备试剂：
二甲苯，无水乙醇

注意事项：（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。）

第一次使用前应在漂洗液RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。
DNase I储存液的配制
将DNase I干粉（1500U）溶解在550μL RNase-Free ddH2O中，轻柔混匀，分装后-20℃贮存（可保存9个月）。
注意：从-20℃融化后的DNase I储存液保存于4℃（可保存6周），不要再次冻存。

起始材料：

标准的福尔马林固定石蜡包埋程序也常常会造成核酸的片段化。为了尽量降低RNA片段化的可能性，应该按照以下操作步骤进行样本处理：
- 组织切除后应尽快浸入4%～10%的福尔马林溶液中；
- 固定时间最好为14-24h（固定时间过长会导致RNA片段化更严重，不利于下游的试验)；
- 样本包被之前必须彻底脱水。
应采用新鲜的FFPE组织切片，切片厚度不超过10μm，切片过厚可能会造成RNA得率低，每次制备采用的切片数应不超过8片，表面积应不超过250mm²。
如果没有起始样本的信息，建议初次制备采用的切片数应不超过2片，然后根据实验结果，下次制备采用的切片数可以进行调整，但应不超过8片。

操作步骤：

将石蜡样品切成5～10μm厚的片状。
注意;如果样品表面暴露于空气中，最初的2～3片弃掉不用。
迅速将2-8张切片置于1.5mL RNase-free的离心管中，加入1mL二甲苯，剧烈涡旋10sec。
室温（15～25℃)，12000rpm （~13400×g)离心2min。
用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀。
加入1mL无水乙醇于沉淀中，涡旋混匀。
室温（15～25℃)，12000rpm （~13400×g)离心2min。
用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀（用一个新的枪头小心吸出残余的乙醇）。
打开管盖，室温（15～25℃)或37℃放置10min直至残余的乙醇挥发完全。
注意：完全去除残余的乙醇很重要，残余的乙醇会对RNA产生影响。
加入150μL裂解液RF以及10μL Proteinase K于沉淀中，彻底涡旋混匀。
55℃孵育15min之后80℃孵育15min。
冰上放置3min，12000rpm （~13400×g)离心15min，转移上清至新的2mL RNaseFree离心管中。
加入16μL的RDD buffer和10μL的DNase I溶液，颠倒混匀。室温放置15min。简短离心以收集管壁及管盖上的液滴。
加入320μL的缓冲液RB，涡旋混匀。
加入1120μL的无水乙醇，涡旋混匀（可能会出现沉淀)。
转移700μL溶液和沉淀入吸附柱CR3中（吸附柱放在收集管中），12000rpm（~13400×g)离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
重复步骤15，直到所有的溶液和沉淀完全通过吸附柱CR3，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW（使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，12000rpm （~13400×g)离心30～60sec，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。
重复步骤17。
室温（15～25℃)，12000rpm （~13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：此步骤目的是将吸附柱CR3中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的RT等实验。
将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30～100μL RNase-Free ddH2O，室温放置2min，12000rpm （~13400×g)离心2min。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于30μL，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存。

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